In de film zie je de ondergang van het eiland Atlantis, lang geleden. Terwijl de bevolking vlucht, ziet het meisje Kida hoe haar moeder zich opoffert om met de kracht van een kristal een deel van het eiland te redden.
Het verhaal gaat verder in het jaar 1914. De jonge taalkundige/cartograaf Milo James Thatch werkt aan zijn theorie over het bestaan van Atlantis. Hij denkt aanwijzingen over de locatie gevonden te hebben dank zij een oud dagboek, het Sheppard’s Journal. Hij probeert een expeditie op touw te zetten, maar niemand neemt hem serieus. Alleen Preston B. Whitmore, een vriend van Milo’s grootvader, toont interesse. Hij onthult dat hij en Milo’s grootvader, Thaddeus Thatch, al langere tijd een expeditie hadden gepland om Atlantis te vinden. Deze kon niet doorgaan omdat Thaddeus stierf en dus wil Whitmore dat Milo nu zijn plaats inneemt. Andere leden van de expeditie zijn commandant Lyle Rourke, zijn assistente Helga Sinclair, de Italiaanse explosievenexpert Vincenzo Vinny Santorini, een doorgedraaide Franse geoloog Gaetan, de arts Dr. Joshua Sweet, de monteur Audrey Ramirez, de kok Jebidiah Allerdyce Cookie Farnsworth en de cynische communicatie-expert Wilhelmina Packard.
De expeditie vertrekt per schip naar de locatie omschreven in het dagboek, waar ze per duikboot verder gaan. De duikboot wordt echter aangevallen door een robotische Leviathan waarbij de meeste bemanningsleden omkomen. Milo’s team haalt het wel en vindt een onderzeese grot. Deze grot leidt uiteindelijk naar Atlantis, of wat daarvan over is. De groep wordt welkom geheten door Kida, die nauwelijks is verouderd sinds de dag dat het eiland wegzonk in zee.
